白光tunel檢查試劑盒（DAB)

【產(chǎn)品簡介】

細胞凋亡中染色體 DNA 的斷裂是個漸進的階段性過程。染色體 DNA 首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為 50-300 kb 的大片段，然后大約 30%的染色體 DNA 在 Ca 2+和 Mg 2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成 180-200 bp 核小體 DNA 多聚體。因此在細胞凋亡晚期，DNA 會被降解為 180-200 bp 的片段，斷裂的基因組 DNA 上暴露出大量的 3′-OH 末端。末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）是一種不依賴于模板的 DNA 聚合酶，可以催化脫氧核苷酸結(jié)合到斷裂的 DNA 分子 3′-OH 末端。因此 TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)細胞凋亡檢測試劑盒可以用來檢測組織細胞在凋亡晚期過程中細胞核 DNA 的斷裂情況。其原理是在 TdT 酶的作用下，在基因組DNA 斷裂時暴露出的 3′-OH 末端摻入生物素標記的 dUTP（Biotin-dUTP），隨后用辣根過氧化物酶（Horse-radish peroxidase，HRP）標記的鏈霉親和素（Streptavidin）(Streptavidin-HRP,SA-HRP)，檢測被生物素（Biotin）標記的 DNA 末端，最后通過加入 HRP 的底物混合液（DAB）進行顯色反應(yīng)，使得凋亡細胞的細胞核被染成棕黃色，從而可以用普通光學顯微鏡檢測。

本試劑盒可適用于石蠟組織切片的細胞凋亡檢測。

【儲存與運輸】

冰袋運輸，-20? C 儲存，可穩(wěn)定儲存一年。

【試劑組成】

【使用方法】

石蠟切片熒光 tunel 實驗步驟

石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min，取出置于通風廚內(nèi)等酒精晾干后放入自來水中稍洗，蒸餾水洗。(冬天應(yīng)提高脫蠟溫度或適當延長脫蠟時間）

通透：PH6.0 檸檬酸修復液中火修復 8min ，室溫冷卻，用免疫組化筆劃圈，之后純水洗三次(重要)。（通透方式有多種：1 蛋白酶消化，2tritonx100 通透劑通透，檸檬酸修復）

配試劑工作液以及孵育：熒光反應(yīng)液（白光 tunel 反應(yīng)液）和 TdT 酶按 50:1 比例混合，此液為 tunel 工作液，，將 tunel 工作液加入到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育 30min 到 2 小時（具體需要預(yù)實驗），濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。

白光 tunel，按以下操作：HRP 二抗孵育以及 DAB 顯色：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min，然后 HRP 二抗工作液室溫孵育 25min（HRP 二抗工作液，Streptavidin-HRP：PBST=1:1000），；玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min；DAB 反應(yīng)液（客戶自備）顯色;酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

封片：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長 330-380nm，發(fā)射波長 420nm；FITC 綠光激發(fā)波長 465-495nm，發(fā)射波長 515-555 nm；CY3 紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長 590nm）

石蠟切片白光 tunel 結(jié)果判讀 白光 tunel 陽性表達為黃色至棕黑色，正常細胞為藍色。

【注意事項】

1. 本試劑僅供科研。

2. 操作時請穿實驗服，佩戴一次性手套。